Качественные и количественные методы исследования в гистологии. Объекты и методы исследования в гистологии

Сегодня уже невозможно себе представить полноценное лечение злокачественного образования без гистологического исследования. Вместе с тем мало кто имеет четкое представление о таком методе диагностики. В статье расскажем о том, как осуществляется проведение гистологического исследования, и о том, зачем оно необходимо. Также поговорим об использовании диагностики такого рода в гинекологии.

Что собой представляет

Гистологический метод исследования заключается в изучении внутренних тканей организма больного, которые берутся в виде маленького образца. Зачастую материал получают посредством биопсии. В диагностике раковых опухолей и оценке правильности медикаментозной терапии гистологическое исследование - один из самых важных этапов.

Цели проведения

Такая диагностика проводится для уточнения или подтверждения ранее поставленного диагноза. Также она помогает верно определить заболевание в спорных ситуациях. Гистологическое исследование материала больного дает возможность на ранней стадии выявить наличие злокачественного образования, изучить динамику его роста (определить, есть ли разрастание, увеличение, распространение опухоли). Кроме того, с помощью него осуществляют дифференциальную диагностику патологических процессов и анализируют изменения, происходящие в ходе лечения в тканях.

Значение в медицине

В настоящее время перед проведением химиотерапевтического или лучевого лечения больных со злокачественными образованиями обязательно назначается гистологическое исследование опухоли. Также без него не проводится ни одна хирургическая операция, связанная с онкологией. Помимо этого, тщательное изучение тканей пациентов нужно для того, чтобы вовремя обнаружить даже малейшие изменения в опухолевом процессе и своевременно принять меры.

Но в лечении не только раковых больных используется гистологическое исследование. Биопсия крайне важна при выборе оптимальной лечебной программы для пациентов с заболеваниями, изучением которых занимаются такие отрасли и разделы медицины, как гинекология, гастроэнтерология, урология, пульмонология, оториноларингология, гематология, нефрология, торакальная и абдоминальная хирургия и др.

Выполнение забора материала

Необходимый для осуществления исследования материал можно получить из любых тканей и внутренних органов пациента. Сегодня имеется много способов произвести данную процедуру:

• Иссечение необходимого количества тканей в процессе хирургической операции (эксцизионная биопсия).
• Прокол полости пораженного органа или злокачественного опухолевого образования при помощи специальной длинной иглы. Такие иглы представлены в различных конструкциях и видах. Посредством пункционной биопсии проводится, к примеру, гистологическое исследование печени.
• Вырезание или отрезание из удаленных внутренних органов небольших кусочков ткани.
• Скусывание специальными щипцами нужного количества ткани при выполнении эндоскопических манипуляций: колоноскопии, бронхоскопии, эзофагогастродуоденоскопии. Такой способ носит название щипцовой биопсии.
• Отсасывание небольшого количества материала из полых внутренних органов (аспирационная биопсия).
• Кюретаж внутренних стенок патологических и естественных полостей. Таким способом проводят, например, гистологическое исследование шейки матки и остеомиелитической полости.

Особенности процедуры

Чтобы получить наиболее достоверные и правильные результаты, необходимо строго выполнять правила забора биологического материала. Образцы ткани, как уже говорилось, можно взять в ходе хирургической операции, когда, к примеру, удаляют часть органа или его целиком, или же в результате биопсии. Большинство врачей предпочитают вторую методику забора материала, она является гораздо более распространенной.

Гистологическое исследование может осуществляться посредством изучения как целого опухолевого образования, так и небольшого столбика ткани. Часто биопсию выполняют с помощью очень длинной и тонкой иглы, которая предназначена для внутримышечных инъекций. Но в отдельных случаях применяют иглу большего диаметра - это делает процедуру более болезненной, но и более эффективной, поскольку специалисты получают возможность провести еще и иммуногистохимический анализ.

Методы диагностики

Есть два методы выполнения гистологического исследования - традиционный и ускоренный. В первом случае полученные образцы ткани сначала заливают расплавленным парафином, а потом нарезают на пластины толщиной 1-8 мкм и подвергают окрашиванию. При применении такого способа данные анализа будут готовы через пять-десять дней.

При использовании ускоренной методики результат гистологического исследования может быть получен в течение часа. В этом случае биологический материал, взятый у пациента, экстренно замораживают, а затем делают в нем послойные тончайшие разрезы и внимательно изучают под микроскопом. Такой метод незаменим, когда хирургу при выполнении операции нужно срочно принять решение относительно того, удалять орган больного или сохранять.

Если гистологическое исследование планируется выполнять не в ближайшее время, а позже, то ткани с целью сохранения структуры заливают спиртом, раствором формалина или осмиевой кислотой. Что касается твердых материй, то их тщательно размягчают.

Результаты анализа

Гистологический метод исследования имеет высокую точность. Это обусловлено тем, что ткани пораженного органа изучаются под микроскопом, а не рассматриваются сквозь другие ткани и органы, как это происходит во время рентгена или ультразвукового исследования. Именно по этой причине гистологический анализ считается наиболее важным для постановки итогового диагноза. Кроме этого, благодаря микроскопии и обязательному окрашиванию тканей пациента специалисты имеют возможность получить самые точные данные о текущем состоянии пораженного органа. Зная утвержденные стандарты структуры тканей и внутренних органов в здоровом состоянии, врач легко может провести оценку патологических изменений и оперативно установить наличие заболевания, а также его степень.

По результатам исследования специалист дает заключение. В нем может стоять ориентировочный или заключительный диагноз, а в ряде случаев дается только описательный ответ, позволяющий высказать лишь предположение о характере патологии (при недостаточности клинических сведений или материала).

Ориентировочный диагноз дает возможность определить круг заболеваний для выполнения дифференциального исследования, а заключительный ответ выступает основой для формулировки клинического диагноза.

Ошибочные данные

Многих пациентов интересует вопрос о том, могут ли быть получены ошибочные результаты при гистологическом исследовании. Такое случается, как правило, если врач неверно выполнил забора биоматериала. Например, взял много здоровых тканей, а пораженный участок органа практически полностью пропустил. Также причиной ошибки могут стать неправильные условия хранения тканей больного или же серьезные нарушения, допущенные во время их подготовки к хранению.

Помимо этого, для получения достоверного результата огромное значение имеет количество срезов - чем их будет больше, тем лучше, поскольку если срезов недостаточно, пораженный участок ткани можно и пропустить, в таком случае тщательного изучения не будет проведено.

Нередко ошибки при осуществлении такой диагностики объясняются недостаточной квалификацией гистолога и отсутствием взаимопонимания между ним и врачом, производящим лечение больного.

Гистологические исследования в гинекологии

В этой отрасли медицины рассматриваемый метод диагностики имеет большое значение. В гинекологии нашли свое применение все гистопатологические виды исследования. Их использование дает возможность установить диагноз с наибольшей степенью достоверности в случае различных патологий женской репродуктивной системы. Особо важную роль играет гистологическое исследование матки, ее придатков, а также шейки матки. Такая диагностика позволяет выявлять онкологические заболевания, а также определять причины замерших беременностей и самопроизвольных выкидышей.

Гистологическое исследование эндометрия

Такой вариант диагностики в гинекологии дает возможность правильно оценить функционирование яичников и своевременно выявить любые патологические процессы, происходящие в них. Если у женщины еще продолжается менструальный цикл, гистологическое исследование эндометрия осуществляют примерно за три дня до начала очередных месячных. В том случае если у пациентки имеют место дисфункциональные кровотечения, соскоб требуется брать непосредственно во время кровотечения.

Полученные посредством диагностического выскабливания биологические ткани для проведения исследования окрашивают при помощи гематоксилина или эозина. В некоторых случаях применяется методика Ван Гизона. После окрашивания путем анализа определяют строение стромы и желез, выявляют все особенности эндометрия. Во время лютеиновой фазы менструального цикла здоровые железы отличаются пиловидной формой, они слегка расширены. Сами клетки железистого эпителия при этом имеют светлую цитоплазму и бледные ядра, а в железах в обязательном порядке обнаруживается секрет.

Гистология шейки матки

Диагностика проводится путем забора из нижнего сегмента детородного органа небольшого количества тканей. Если при проведении анализа в них обнаруживаются незначительные патологические изменения, то можно утверждать о наличии у пациентки доброкачественного образования или воспалительного заболевания. В том случае если клеток с патологическими изменениями выявлено много, говорят о развитии злокачественной опухоли или предраковом состоянии.

Гистология матки

Гистологическое исследование детородного органа осуществляется исключительно по показаниям. Такая диагностика выполняется, если, к примеру, женщину мучают боли в нижней части живота или у нее наблюдаются длительные маточные кровотечения, если выявляется опухолевое образование при прощупывании живота и так далее.

Биологический материал берется для исследования во время диагностической гистероскопии - это малоинвазивное обследование внутренней поверхности детородного органа посредством гистероскопа - специального оптического прибора. Надо отметить, что процедура является довольно сложной, осуществляется зачастую под общим наркозом (в редких случаях применяют местное обезболивание). Инструментами, входящими в состав гистероскопа, специалист берет кусочки ткани, которые затем отправляются на гистологическое исследование, в ходе которого можно точно установить, что послужило причиной неприятных симптомов. Такая диагностика также позволяет отличить доброкачественное образование (к примеру, миому) от злокачественного.

Гистология яичников

В этом случае забор биологического материала для гистологического анализа выполняют посредством пункционной биопсии (делают прокол передней брюшной стенки). В настоящее время такая процедура осуществляется под контролем ультразвукового исследования - это дает возможность получить ткань непосредственно из тех участков, которые вызывают подозрение. Проведение такой диагностики позволяет отличить доброкачественную опухоль и кисту от рака яичника.

Основным методом исследования в гистологии является микроскопирование – изучение гистологических препаратов под микроскопом. В последнее время микроскопия сочетается с другими методами – гистохимией и гисторадиографией. Для микроскопии используют различные конструкции микроскопов, позволяющие изучать различные параметры гистологических препаратов.

Выделяются следующие виды микроскопии:

1) световая микроскопия (наиболее распространенный вид микроскопии, при этом разрешающая способность микроскопа составляет 0,2 мкм);

2) ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность микроскопа составляет 0,1 мкм);

3) люминисцентная микроскопия (применяется для определения в исследуемом гистологическом препарате определенных химических структур);

4) фазово-контрастная микроскопия (применяется для обнаружения и изучения определенных структур в неокрашенных гистологических препаратах);

5) поляризационная микроскопия (используется в основном для изучения волокнистых структур);

6) микроскопия в темном поле применяется для изучения живых объектов;

7) микроскопия в падающем свете (предназначена для изучения толстых объектов);

8) электронная микроскопия (наиболее современный вид микроскопии, имеющий разрешающую способность 0,1 – 0,7 нм). Имеются две разновидности электронной микроскопии – просвечивающая (трансмиссионная) и сканирующая (или растворная) микроскопия, дающая отображение поверхностных ультраструктур.

Гистологические и цитохимические методы применяются для определения состава химических веществ и их количества в определенных структурах. Принцип метода заключается в химической реакции между реактивом и субстратом, содержащимся в исследуемом веществе. При этом образующиеся побочные продукты реакции можно обнаружить с помощью световой или люминисцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в исследуемых структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов. Данный метод чаще всего используется при экспериментах на животных.

Метод интерферонометрии позволяет определять сухую массу вещества в живых или фиксированных объектах.

Метод культуры клеток – это выращивание клеток в пробирках или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Метод витального окрашивания – введение животным в кровь или в брюшную полость красителя (трепанового синего), который при жизни животного захватывается определенными клетками – макрофагами, а после забоя животного и приготовления препарата определяются и подсчитываются клетки, содержащие краситель.

Иммуноморфологические методы позволяют с помощью предварительно проведенных иммунных реакций (на основе взаимодействия антиген – антитело) определять субпопуляцию лимфоцитов, степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов, т. е. определять их гистосовместимость для дальнейшей трасплантации.

Метод дифференциального центрифугирования – изучение отдельных органелл или даже их фрагментов, выделенных из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2 до 150 тыс. в 1 мин). В результате центрифугирования получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Методы морфометрии – количественные методы. Они позволяют определять размеры и объемы ядра – кариометрия, клеток – цитометрия, органелл – электронная морфометрия, а также определять число клеток различных популяций и субпопуляций. Данные методы широко используются в научных исследованиях.

Различные экспериментальные методы – пищевая и водная нагрузка, физические методы (УВЧ, СВЧ, лазеры, магниты). Они применяются для изучения реакции интересующих структур на то или иное воздействие и сочетаются с методами морфометрии, цито– и гистохимии. Данные методы также применяются в научных исследованиях.

Таким образом, основным и наиболее распространенным методом изучения в гистологии является микроскопия. Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.

Взятие материала

– кусочка ткани или органа. При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:

1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;

2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

3) толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;

4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.

Фиксация материала

Данный этап проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада. Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор. Раствор может быть простым (спирт или формалин) и сложным (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера). Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.

Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды

(парафин, смолы) – или замораживание. Данный этап необходим для того, чтобы в последующем из исследуемой ткани можно было изготовить тонкий срез.

Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей

После этого срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование

(для электронной микроскопии). Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду – выполнить депарафирование. С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Часто используются и сложные красители.

Просветление срезов в ксилоле и толуоле

Их заключают в смолы (бальзам и полистирол) и закрывают покровным стеклом.

После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.

Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.

Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.

Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.

2. Объекты исследования гистологии

3. Приготовление гистологических препаратов

4. Методы исследования

5. Исторические этапы развития гистологии

1. Гистология наука о микроскопическом и субмикроскопическом строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов. Следовательно, гистология изучает один из уровней организации живой материи тканевой. Различают следующие иерархические уровни организации живой материи:

клеточный;

тканевой;

структурно-функциональные единицы органов;

органный уровень;

системный уровень;

организменный уровень

Гистология, как учебная дисциплина , включает в себя следующие разделы: цитологию, эмбриологию, общую гистологию (изучает строение и функции тканей), частную гистологию (изучает микроскопическое строение органов).

Основным объектом изучения гистологии является организм здорового человека и потому данная учебная дисциплина именуется как гистология человека.

Основная задача гистологии состоит в изучении строения клеток, тканей, органов, установления связей между различными явлениями, установление общих закономерностей.

Гистология, как и анатомия, относится к морфологическим наукам, главной задачей которых является изучение структур живых систем. В отличие от анатомии, гистология изучает строение живой материи на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом, изучение строения различных структурных элементов проводится в настоящее время с учетом выполняемых ими функций. Такой подход к изучению структур живой материи называется гистофизиологическим, а гистология нередко именуется как гистофизиология. Кроме того, при изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматривается не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методом цито- и гистохимии нередко определяется и состав веществ, образующих эти структуры. Наконец, изучаемые структуры обычно рассматриваются с учетом их развития, как во внутриутробном (эмбриональном) периоде, так и на протяжении постэмбрионального онтогенеза. Именно с этим связана необходимость включения эмбриологии в курс гистологии.

Гистология, как любая наука, имеет свои объекты и методы их изучения. Непосредственными объектами изучения являются клетки, фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом.

2. Объекты исследования подразделяются на:

живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);

мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

В любом случае после взятия кусочков они подвергаются действию фиксирующих растворов или замораживанию. И в научных, и в учебных целях используются фиксированные объекты. Приготовленные определенным способом препараты, используемые для изучения под микроскопом, называются гистологическими препаратами.

Гистологический препарат может быть в виде:

тонкого окрашенного среза органа или ткани;

мазка на стекле;

отпечатка на стекле с разлома органа;

тонкого пленочного препарата.

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:

сохранять прижизненное состояние структур;

быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;

быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;

препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

3. Выделяют следующие этапы приготовления гистологического препарата

Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты: забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа; забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани; толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка; обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).

Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми спирты и формалин и сложными раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО2, жидким азотом и другие). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.

Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.

Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.

Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.

4. Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование , т. е. изучение гистологических препаратов по микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:

световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;

ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);

люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;

фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратов;

поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;

микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;

микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;

электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.

Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.

Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.

Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Единицы измерения, используемые в гистологии

Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм.

5. В истории развития гистологии условно выделяют три периода:

Домикроскопический период (с IV в. до н. э. по 1665 г.) связан с именами Аристотеля, Галена, Авиценны, Везалия, Фаллопия и характеризуется попытками выделения в организме животных и человека неоднородных тканей (твердых, мягких, жидких и так далее) и использованием методов анатомической препаровки.

Микроскопический период (с 1665 г. по 1950 г.). Начало периода связывают с именем английского физика Роберта Гука, который, во-первых, усовершенствовал микроскоп (полагают, что первые микроскопы были изобретены в самом начале XVII в.), во-вторых, использовал его для систематического исследования различных, в том числе биологических объектов и опубликовал результаты этих наблюдений в 1665 г. в книге "Микрография", в-третьих, впервые ввел термин "клетка" ("целлюля"). В дальнейшем осуществлялось непрерывное усовершенствование микроскопов и все более широкое использование их для изучения биологических тканей и органов.

Особое внимание уделялось изучению строения клетки. Ян Пуркинье описал наличие в животных клетках "протоплазмы" (цитоплазмы) и ядра, а несколько позже Р. Броун подтвердил наличие ядра и в большинстве животных клеток. Ботаник М. Шлейден заинтересовался происхождением клетокцитокенезисом. Результаты этих исследований позволили Т. Швану, на основании их сообщений, сформулировать клеточную теорию (1838-1839 гг.) в виде трех постулатов:

все растительные и животные организмы состоят из клеток;

все клетки развиваются по общему принципу из цитобластемы;

каждая клетка обладает самостоятельной жизнедеятельностью, а жизнедеятельность организма является суммой деятельности клеток.

Однако вскоре Р. Вирхов (1858 г.) уточнил, что развитие клеток осуществляется путем деления исходной клетки (любая клетка из клетки). Разработанные Т. Шваном положения, клеточной теории актуальны до настоящего времени, хотя формулируется по-иному.

Современные положения клеточной теории:

клетка является наименьшей единицей живого;

клетки животных организмов сходны по своему строению;

размножение клеток происходит путем деления исходной клетки;

многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток и их производных, объединенные в системы тканей и органов, связанные между собой клеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.

Дальнейшее совершенствование микроскопов, особенно создание ахроматических объективов, позволило выявить в клетках более мелкие структуры:

клеточный центр Гертвиг, 1875 г.;

сетчатый аппарат или пластинчатый комплекс Гольджи, 1898 г.;

митохондрии Бенда, 1898 г.

Современный этап развития гистологии начинается с 1950 г. с момента начала использования электронного микроскопа для изучения биологических объектов, хотя электронный микроскоп был изобретен раньше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 г.). Однако для современного этапа развития гистологии характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов: цито- и гистохимии, гисторадиографии и других вышеперечисленных современных методов. При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.

ЛЕКЦИЯ 2. Цитология. Цитоплазма

Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии Часть I

Ивановская государственная медицинская академия
Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии
Методы исследования в
гистологии, цитологии и
эмбриологии
Часть I
к.м.н., старший преподаватель М.Р. Гринева
д.м.н., профессор С.Ю. Виноградов
д.м.н., профессор С.В. Диндяев
далееВведение
Методы исследования живых клеток и тканей
Виды гистологических препаратов фиксированных клеток
Изготовление гистологического препарата
Гистологический препарат
Взятие материала
Фиксация материала
Уплотнение материала
Приготовление срезов
Виды микротомов
Окрашивание срезов
Методы окрашивания
Типы красителей
Заключение срезов в консервирующую среду
Методы микроскопии
Световая микроскопия
Устройство светового микроскопа
Техника микроскопирования
Темнопольная микроскопия
Поляризационная микроскопия
Фазово-контрастная микроскопия
Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия
Электронная микроскопия
Рекомендуемая литература
назад
далее

Введение

В современной гистологии, цитологии и эмбриологии применяются
разнообразные методы исследования, позволяющие всесторонне изучать
процессы развития, строения и функции клеток, тканей и органов.
Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются
выбор объекта исследования
подготовка его к микроскопированию
применение методов микроскопирования
качественный и количественный анализ изображения
Объектами
исследования
служат
гистологические
изготовленные из живых или фиксированных клеток.
препараты,
оглавление далее

Методы исследования живых клеток и тканей

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную
информацию об их жизнедеятельности – проследить процессы движения,
деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток,
продолжительность их клеточного цикла, реактивные изменения в ответ на
действие различных факторов.
Методы
Прижизненное
в организме (in vivo)
Вживление прозрачных камер
Прижизненная микроскопия
Трансплантация
Прижизненное в культуре
клеток и тканей (in vitro)
Суспензионные культуры
Монослойные культуры
Культивирование in vivo
назад
оглавление далее

Виды гистологических препаратов фиксированных клеток

Срез
тонкие (толщина
более 1 мкм)
полутонкие
(толщина менее
1 мкм)
ультратонкие
(толщина менее
0,1 мкм)
Мазок
крови
красного
костного
мозга
спинномозговой
жидкости
слюны
влагалищный
и др.
Отпечаток
селезенки
тимуса
печени
слизистой
оболочки
мочевого
пузыря
слизистой
оболочки
щеки
и др.
назад
Пленка
брюшины
плевры
мягкой мозговой
оболочки
соединительной
ткани
и др.
оглавление далее

Изготовление гистологического препарата

назад
оглавление далее

Гистологический препарат

Гистологические препараты, как правило, представляют собой срезы (толщиной
5-15 мкм) органов, тканей или клеток, окрашенные специальными гистологическими
красителями.
Гистологический препарат должен отвечать следующим требованиям:
сохранять прижизненное состояние структур;
быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под
микроскопом в проходящем свете;
быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под
микроскопом четко определяться;
препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и
использоваться для повторного изучения.
Процесс изготовления гистологического препарата включает включает следующие
основные этапы:
1. Взятие и фиксация материала
2. Уплотнение материала
3. Приготовление срезов
4. Окрашивание срезов
5. Заключение срезов в прозрачную среду
назад оглавление далее

Взятие материала

Изготовление гистологического препарата производится из органов и тканей,
полученных несколькими путями:
биопсия (пунктат),
операционным путем,
секционный (трупный) материал,
экспериментальный
При этом должны учитываться следующие моменты:
1. Забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти
или забоя экспериментального животного, а при возможности от живого
объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или
органа.
2. Забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не
травмировать ткани.
3. Толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий
раствор мог проникнуть в толщу кусочка.
4. Обязательно
производится
маркировка
кусочка
(указывается
наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата
забора и так далее).
назад оглавление далее

Фиксация материала

Цель фиксации материала – сохранение прижизненного морфологию
клеток и тканей, предотвращение аутолиза и посмертных изменений.
Фиксатор вызывает денатурацию белка и стабилизацию липидов и тем
самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их
прижизненном состоянии.
Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие
жидкости, которые могут быть простыми (формалин, спирты, глутаровый
альдегид, ацетон) и сложными (раствор Карнуа, фиксатор Ценкера и др.).
Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе
СО2, жидким азотом и др.).
Подбор фиксаторов и продолжительность фиксации индивидуален для
различных органов и тканей и обычно колеблется от 2 до 24 часов.
назад оглавление далее

Уплотнение материала

Целью этого этапа является придание исследуемому материалу такой
плотности, которая позволит получить тонкие срезы необходимой толщины.
Этого достигают двумя способами:
Замораживание образца с последующей резкой на замораживающем
микротоме.
Пропитывание уплотняющими средами (парафин, эпоксидные смолы и др.)
Основные этапы парафиновой проводки:
Промывка материала проточной водопроводной водой для удаления
фиксатора.
Обезвоживание (дегидратация) материала в спиртах увеличива-ющейся
концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%).
Удаление спирта и подготовка материала к пропитыванию парафином
обработкой растворителями парафина (ксилол и др.) и смесью парафина и
ксилола (при температуре 37°С)
Заливка в чистый расплавленный парафин (при температуре 56°С).
Охлаждение парафина и формирование блоков.
назад оглавление далее

Приготовление срезов

Для изготовления тонких срезов заданной толщины в настоящее время
используются специальные приборы – микротомы (для световой микроскопии)
и ультрамикротомы (для электронной микроскопии).
Специальные ножи микротомов позволяют получить срезы толщиной:
3-8 мкм из материала, залитого в парафин,
10-25 мкм из материала, замороженного в камере микротома-криостата
0,08-0,1 мкм из материала, подготовленного для электронной микроскопии
Полученные срезы помещают на предметные стекла (для световой
микроскопии) или монтируются на специальные сеточки (для электронной
микроскопии).
назад оглавление далее

Виды микротомов

санный
ротационный
криостатный
замораживающий
для экспрессдиагностики,
гистохимии
вибротом
изготовление
парафиновых
срезов
изготовление
серийных
парафиновых
срезов
изготовление
срезов при
температуре
-20°С и ниже
для гистохимии
и иммуноцитохимии
изготовление
срезов фиксированных и
нефиксированных тканей
назад оглавление далее

Окрашивание срезов

Клеточные
структуры
без
специальной
обработки,
как
правило,
не
различимы даже при большом увеличении микроскопа. Они бесцветны и
прозрачны.
Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток, внутриклеточных
структур используют красители – вещества с высоким сродством к различным
компонентам ткани и с определенными цветооптическими свойствами.
Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от
кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав.
Перед окрашиванием срезы депарафинируют, проводя последовательно
через растворитель парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации (100,
96, 90, 80, 70%) и помещают в воду.
назад оглавление далее

Методы окрашивания

Общегистологические
Специальные
Гистохимические
выявление
общего плана
строения
клеток, тканей,
органов
выявление
специализированных
структур в
клетках и
тканях
анализ
химического
состава клеток
и
межклеточного
вещества
назад
Импрегнация
выявление
специализированных
структур в
клетках и
тканях
оглавление
далее

Импрегнация

Метод выявления тканевых структур путем пропитывания объектов
гистологического исследования растворами солей тяжелых и драгоценных
металлов (например, азотнокислое серебро (серебрение), кобальт, хлористое
золото (золочение), кадмий, осмиевым ангидрид и др.).
Участки ткани, в которых происходит осаждение солей металлов на
гистологических структурах, приобретают черный или бурый цвет в
зависимости от количества и свойств восстановленного металла.
Периферический нерв
(поперечный срез).
Импрегнация оксидом
осмия
Мультиполярный нейрон.
Импрегнация нитратом серебра
Мультиполярные нейроны.
Импрегнация нитратом серебра
назад оглавление далее

Типы общегистологических красителей

основные
основания,
связываясь с
кислотными
соединениями
гистологических
структур, вызывают
обычно их
окрашивание в синефиолетовые цвета
базофилия
метахромазия
нейтральные
кислые
содержат как
основные, так и
кислые красящие
компоненты
соединяясь с
основными
(щелочными)
соединениями
гистологических
структур,
окрашивают их в
цвета красителя
нейтрофилия
оксифилия
назад
оглавление далее

Базофилия

Основные (щелочные) красители активно связываются со структурами, которые
содержат кислоты и несут отрицательный заряд – например, ДНК, РНК.
К ним, в частности, относятся гематоксилин, толуидиновый синий, тионин,
метиленовый синий, азуры и др.
Способность окрашиваться основными (щелочными) красителями называется
базофилией (от греч. basis – основа и philia – любовь).
Поэтому структуры, связывающие эти красители, называются базофильными.
В клетке базофилией обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК),
иногда цитоплазма (при высоком содержании в ней рибосом или гранулярной ЭПС).
Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей – например,
хрящевой.
Базофилия ядра
нейтрофильного гранулоцита.

Увеличение: х630.
назад
оглавление далее

Метахромазия

Метахромазия (от греч. meta – изменение и chroma – цвет, краска) – изменение цвета
некоторых основных красителей при их связывании со структурами, обладающими
специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией
сульфатированных гликозаминогликанов).
К таким красителям относятся толуидиновый синий, азур II, тионин и др.
Способность метахроматически окрашиваться обладают гранулы базофильных
лейкоцитов, тучных клеток.
Указанные красители окрашивают другие базофильные структуры в тех же тканях в
обычный свойственный им цвет, т.е. ортохроматически (от греч. orthos – правильный и
chroma – краска).
Метахромазия зернистости
базофильного гранулоцита.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Увеличение: х630.
назад оглавление далее

Оксифилия

Кислые красители связываются со структурами, имеющими положительный заряд –
например, белки.
К таким красителям относятся эозин, оранж G, эритрозин, пикриновая кислота и др.
Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или
ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus – кислый и греч. philia – любовь).
Структуры, связывающие
ацидофильными.
эти
красители,
называются
оксифильными
или
Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (особенно при высоком содержании в
ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря
высокой концентрации в них гемоглобина). Оксифильно окрашивается цитоплазма
кардиомиоцитов, мышечных волокон скелетной мускулатуры, некоторые компоненты
межклеточного вещества (например, коллагеновые волокна).
Оксифилия зернистости
эозинофильного гранулоцита.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Увеличение: х630.
назад
оглавление далее

Нейтрофилия

Нейтрофилия
(от
лат.
neutrum
–
ни
тот,
ни
другой,
и
philia - предрасположение, любовь) – способность гистологических структур
окрашиваться и кислыми, и основными красителями.
Нейтрофилия зернистости
нейтрофильного гранулоцита.
Окраска по Романовскому-Гимзе.
Увеличение: х630.
назад
оглавление далее

Заключение срезов в консервирующую среду

Окрашенные гистологические препараты обезвоживаются в спиртах
восходящей концентрации (70, 80, 90, 96, абсолютный – 100%) и
просветвляются в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах.
Для длительного хранения обезвоженный гистологический срез заключают
(монтируют) в прозрачную консервирующую среду (смолу хвойных деревьев –
канадский, пихтовый бальзам, а также в синтетические среды).
На постоянном гистологическом препарате срез ткани располагается на
предметном стекле, сверху закрыт покровным стеклом. Между стеклами
(предметным и покровным) находится заливочная среда, обладающая
коэффициентом преломления световых лучей, близким к таковому у стекла.
назад оглавление далее

Методы микроскопии

оглавление далее

Методы микроскопии

Оптическая
Световая
Поляризационная
Темнопольная
Фазовоконтрастная
Электронная
Просвечивающая
(трансмиссионная)
Сканирующая
(растровая)
Флюоресцентная
(люминесцентная)
назад оглавление далее

Световая микроскопия

Изучение гистологического препарата осуществляется в проходящем свете
с помощью светового микроскопа.
Источник света естественный или искусственный (различные лампы). Свет
собирается в конденсор и далее направляется через препарат в объектив.
Окуляр дополнительно увеличивает это изображение.
Качество
изображения
(четкость)
определяется
разрешающей
способностью микроскопа, т.е. минимальным (разрешающим) расстоянием,
на котором оптика микроскопа позволяет различить раздельно две близко
расположенные точки. Эта величина пропорциональна длине световой волны и
для обычного светового микроскопа равна приблизительно 0,2 мкм.
Чем меньше разрешающее расстояние, тем выше разрешающая способность
микроскопа и тем более мелкие объекты можно исследовать.
Увеличение микроскопа – это соотношение между истинными размерами
исследуемого объекта и размерами его изображения, получаемого с помощью
микроскопа. Ориентировочно оно оценивается как произведение увеличений
объектива и окуляра и может достигать 2500 раз.
назад оглавление далее

Устройство светового микроскопа

4
3
5
2
6
7
8
1
12
11
10
9
Основание микроскопа
Тубусодержатель
Тубус
Окуляр (чаще ×7)
Револьвер микроскопа
Объективы
а) сухие: ×8, ×20, ×40
б) иммерсионный ×90
7. Предметный столик
8. Конденсор
9. Макрометрический винт
10.Микрометрический винт
11.Винт конденсора
12.Зеркало
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Общее увеличение микроскопа = увеличение объектива × увеличение окуляра
назад
оглавление далее

Техника микроскопирования

1. Микроскопирование гистологического препарата начинают с установки правильного
освещения. Для этого с помощью вогнутого зеркала, собирающего рассеянный пучок
света, и конденсора достигают равномерного освещения поля зрения.
2. На предметный столик помещают гистологический препарат покровным стеклом вверх.
3. Изучение гистологического препарата начинают при малом увеличении (объектив х8), при
этом расстояние между объективом и покровным стеклом должно быть около 1 см.
Установку резкости проводят с помощью макровинта.
4. Рассматривают детали гистологического препарата по всей площади, перемещая его на
предметном столике.
5. Устанавливают в центр поля зрения участок гистологического препарата, который следует
изучить при большом увеличении (объектив х40).
6. С помощью револьверного устройства ставят объектив с более сильным увеличением
(х40). Установку резкости проводят с помощью микровинта.
7. Для изучения очень мелких гистологических структур используют иммерсионный
объектив (х90).
На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла.
Осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива к маслу.
Установку резкости проводят с помощью микровинта.
После окончания работы иммерсионное масло удаляют с объектива и покровного
стекла марлей.
назад оглавление далее

Техника микроскопирования (примеры)

Почка.
Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: х 56
(малое увеличение).
Почка.
Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: х 280
(большое увеличение).
Почка.
Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: х 630
назад
(иммерсионное
увеличение).
оглавление далее

Темнопольная микроскопия

Основана на использовании специального конденсора, освещающего
препарат «косыми» лучами, не попадающими в объектив.
При наличии объекта в поле зрения свет отражается от него и
направляется в объектив.
Метод часто используется для изучения живых неокрашенных клеток.
назад
оглавление далее

Поляризационная микроскопия

Позволяет обнаружить двойное лучепреломление – анизотропию.
На объект исследования направляется поляризованный пучок света, т.е. лучи света
направлены строго в одной плоскости.
Это обеспечивает особый фильтр – поляризатор. Такой свет направляется на объект
исследования.
Второй фильтр – анализатор расположен между объективом и окуляром и позволяет
регистрировать угол отклонения плоскости поляризации света.
Микроскопия позволяет регистрировать пространственное расположение молекул в
объективе или кристаллические структуры.
Кристаллы оксалатов.
Поляризационная
микроскопия.
Увеличение х100
назад оглавление далее

Фазово-контрастная микроскопия

Метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, в
частности, позволяет изучать живые неокрашенные препараты.
Даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата
световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает
фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые глазом, преобразуются с помощью
специального оптического устройства (кольцевой диафрагмы в конденсоре и фазовой пластинки в
объективе) в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный
рельеф»), которые уже различимы глазом.
Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд)
воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазовоконтрастным.
Pseudotrichonympha grassi.
Неокрашенный препарат.
Фазовый контраст
Семенники крысы.
Неокрашенный препарат.
Фазовый контраст
Семенники крысы.
Окраска: гематоксилин-эозин
Световая микроскопия
назад оглавление далее

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия

Использует принцип свечения объекта исследования при освещении его
ультрафиолетовыми лучами. Источником света служат специальные лампы.
Существует аутофлюоресценция – собственная или первичная
флюоресцен-ция. Например, свечение эластических волокон в стенке артерий.
Вторичная флюоресценция возникает после обработки препаратов
специальными красителями – флюорохромами (акридин оранжевый, родамин,
флюоресцин и др.).
Например: после обработки акридиновым оранжевым в клетке очень четко
обнаруживается ядерная ДНК (ярко-зеленое свечение) и РНК (ярко-красное
свечение). После фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька)
обнаруживается
ярко-зеленое
свечение
серотонина,
катехоламинов
(адреналин, норадреналин).
Если флюоресцентные красители связать со специфическими антителами
– можно будет выявить их антигены. Этот метод получил название
иммуноцитохимического.
назад оглавление далее

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (примеры)

.
.
.
.
Цитоскелет эукариот
(эндотелиальные клетки быка).
Имунноцитохимический метод
окрашивания.
Актиновые микрофиламенты
окрашены в красный,
микротрубочки - в зеленый, ядра
клеток - в голубой цвет.
Нуклеиновые кислоты
в эпителии маточных
желез.
Окраска акридиновым
оранжевым.
Ядерная ДНК окрашена в
зеленый цвет,
РНК – в красный.
назад
Симпатические
нервные сплетения.
Метод Фалька
оглавление далее

Электронная микроскопия

Электронный микроскоп - прибор, позволяющий получать изображение объектов с
максимальным увеличением до 106 раз. Это стало возможно благодаря использованию
вместо светового потока пучка электронов, длина волны которого во много раз короче
длины волны фотонов видимого света.
Электронный микроскоп состоит из электронной пушки (устройства для получения
пучка электронов) и системы электромагнитных линз, размещенных в колонне
микроскопа в условиях вакуума.
Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит
разрешение светового микроскопа и для лучших современных приборов может
составлять менее 0,1 нм (10-10м).
Существуют
две
основные
разновидности
электронной
трансмиссионная (просвечивающая) и сканирующая (растровая).
назад
микроскопии:
оглавление далее

Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия

Принцип работы трансмиссионного электронного микроскопа заключается в том, что
электроны, проходя через объект, расположенный вблизи объективной линзы,
взаимодействуют с его атомами и отклоняются от первоначального направления падения
пучка (рассеиваются). Далее они попадают в систему магнитных линз, которые
формируют на флуоресцентном экране (и на фотопленке) изображение внутренней
структуры объекта. При этом удается достичь разрешения порядка 0,1 нм, что
соответствует увеличениям до 1,5 106 раз.
Разрешение и информативность ТЭМ-изображений во многом определяются
характеристиками объекта и способом его подготовки. Для получения контрастного
изображения применяют ультратонкие срезы (не более 0,01 мкм), обработанные
соединениями тяжелых металлов (импрегнация солями свинца, урана, осмия и др.),
избирательно взаимодействующими с компонентами микроструктуры (химическое
контрастирование). При этом чем большей рассеивающей способностью обладает
участок исследуемого объекта (участки повышенной плотности, увеличенной толщины и
пр.), тем более темным будет его изображение.
назад оглавление примеры

Сканирующая (растровая) электронная микроскопия

Принцип работы сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) заключается в
сканировании поверхности образца сфокусированным электронным пучком и анализе
отраженных от нее частиц и рентгеновского излучения, возникающего в результате
взаимодействия электронов с веществом.
В СЭМ пучок электронов (электронный зонда) фокусируется электромагнитными
линзами конденсора и объектива. Специальное устройство – дефлектор отклоняет
электронный пучок (первичные электроны), который скользит по поверхности (растр).
Вторичные электроны (отраженные от поверхности) воспринимаются детектором и
фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение.
Современный СЭМ позволяет работать в широком диапазоне увеличений
приблизительно от х10 (что эквивалентно увеличению сильной ручной линзы)
до х1 000 000, что приблизительно в 500 раз превышает предел увеличения лучших
оптических микроскопов.
Поверхность сканирования обязательно напыляется металлом: платина, золото,
палладий и др.
назад оглавление примеры

Электронная микроскопия (примеры)

трансмиссионная
сканирующая
.
.
.
Эритроциты в артериоле
.
.
.
Тучная клетка
назад
Эритроцит,
тромбоцит,
лейкоцит
оглавление
далее1. Гистология, цитология и эмбриология: Учебник. / Под ред. Ю.А.Афанасьева,
С.Л.Кузнецова, Н.А.Юриной. – М.: Медицина, 2006. – 768 с.
2. Гистология, эмбриология, цитология: Учебник. /
Ю.А.Челышева. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2007. – 408 с.
Под
ред.
Э.Г.Улумбекова,
3. Жункейра Л.К., Карнейро Ж. Гистология: Атлас: Уч.пос.; пер. с англ., под ред. В.Л.
Быкова. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», 2009. – 576 с.
4. Хэм А., Кормак Д. Гистология: в 5 томах; пер. с англ. – М.: Мир, 1982.
назад
оглавление

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные - неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.

Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии - в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду - парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) - для электронно-микроскопического исследования.

Существуют также физические способы фиксации материала , наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы - криостаты, или замораживающие микротомы.

Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии , не должна превышать 4-5 мкм, для электронной - 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).

После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).

По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.

Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа - это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии - фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.

Фазово-контрастная микроскопия - метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.

Интерференционная микроскопия . В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются - один пучок проходит через объект, другой - идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.

Поляризационная микроскопия . В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).